Giai đoạn đầu

Năm 1963, ở tuổi 20, De Niro có vai diễn điện ảnh đầu tiên khi đạo diễn nổi tiếng Brian De Palma chọn De Niro vào bộ phim The Wedding Party, tác phẩm này mãi đến năm 1969 mới được phát hành. Trong suốt thập niên 1960 Robert dành phần lớn thời gian tham gia sân khấu kịch và chỉ tham gia một số bộ phim như Trois chambres à Manhattan (1965, phim Pháp, De Niro chỉ đóng vai quần chúng) và Greetings (1968, một tác phẩm khác của De Palma).

Vai diễn điện ảnh đáng chú ý đầu tiên của De Niro là vai một vận động viên bóng chày trong Bang the Drum Slowly (1973). Cùng năm này, De Niro cũng bắt đầu mối hợp tác lâu dài và thành công với đạo diễn Martin Scorsese khi tham gia bộ phim Mean Streets của đạo diễn này. Năm 1974 Robert De Niro có vai diễn bước ngoặt, đó là vai "Bố già" Don Vito Corleone thời trẻ trong bộ phim Bố già phần II (The Godfather Part II) của Francis Ford Coppola. Vai diễn này đã mang về cho De Niro Giải Oscar đầu tiên khi ông được trao giải Vai nam phụ xuất sắc nhất năm 1975, 2 năm sau khi Marlon Brando được trao giải Vai nam chính xuất sắc nhất cũng nhờ chính vai diễn Vito Corleone này trong Bố già (The Godfather). Brando và De Niro sau này đã cùng đòng chung trong bộ phim The Score (2001).

Martin Scorsese có lẽ là đạo diễn hợp tác thành công nhất với Robert De Niro. Sau Mean Streets, De Niro còn tham gia rất nhiều phim của Scorsese, trong đó phần lớn Robert thủ vai nhân vật phản diện như Taxi Driver (1976), New York, New York (1977), Raging Bull (1980), The King of Comedy (1983), Goodfellas (1990), Cape Fear (1991) và Casino (1995). Riêng vai diễn ấn tượng Travis Bickle trong Taxi Driver đã giúp Robert De Niro có được đề cử Oscar đầu tiên cho hạng mục vai chính.

Năm 1978, De Niro vào vai Michael Vronsky trong bộ phim về đề tài Chiến tranh Việt Nam The Deer Hunter. Vai diễn này đã mang về cho Robert một đề cử nữa cho Giải Oscar Nam diễn viên chính.

Giai đoạn sau

Robert De Niro nổi tiếng là người đầu tư kỹ lưỡng cho vai diễn. Để vào vai tay đấm Jake LaMotta trong bộ phim Raging Bull (1980) của Martin Scorsese, Robert đã phải tăng 27 kg và học cách đấm bốc thực sự. Chính nhờ sự chuẩn bị tốt và diễn xuất mẫu mực trong vai này mà Robert De Niro đã được trao tượng vàng Oscar ở hạng mục Nam diễn viên chính xuất sắc nhất. Trước đó để vào vai Vito Corleone, De Niro đã sang Sicila sống một thời gian và cũng để trải nghiệm nhân vật trong Taxi Driver, ông đã dành hẳn 3 tháng để làm tài xế taxi thực sự.

Sau khi đạt được các thành công với những vai phản diện, Robert De Niro thử nghiệm khả năng diễn xuất trong thể loại hài và ông cũng thành công với các bộ phim như Midnight Run (1988), Showtime (2002), Meet the Parents (2000) và Meet the Fockers (2004). Cũng trong năm 2004, De Niro lần đầu tiên tham gia vai trò lồng tiếng cho một bộ phim hoạt hình, đó là vai cá mập Don Lino trong Câu chuyện cá mập (Shark Tale).

Năm 1995 De Niro tham gia bộ phim của đạo diễn Michael Mann Heat. Đây là lần đầu tiên ông diễn chung với Al Pacino, cũng là một ngôi sao nổi tiếng trong các vai phản diện hay trùm băng đảng. De Niro và Al Pacino đã từng cùng tham gia bộ phim Bố già phần II nhưng do một người thủ vai Vito Corleone thời trẻ, một người thủ vai Michael Corleone vì vậy hai người chưa hề cùng xuất hiện trong một cảnh quay.

Năm 2006 De Niro đã phải từ chối vai Oliver Queenan trong Điệp vụ Boston (The Departed) của đạo diễn quen thuộc Scorsese vì bận chuẩn bị cho bộ phim The Good Shepherd do chính Robert đạo diễn (Martin Sheen là diễn viên thay thế). Robert De Niro đã tỏ ý rất tiếc vì đã bỏ lỡ vai diễn này[3]

Thử nghiệm trong vai trò đạo diễn

Năm 1993 De Niro đạo diễn bộ phim đầu tay có tên A Bronx Tale. Kịch bản phim do Chazz Palminteri thực hiện viết về thời niên thiếu ngỗ nghịch của chính tác giả ở khu Bronx. De Niro đã đồng ý đạo diễn A Bronx Tale sau khi xem vở kịch do một mình Chazz thủ vai. Trong tác phẩm đầu tay này Robert vào vai một tài xế xe buýt phải tìm cách tách đứa con trai ra khỏi tầm ảnh hưởng của tay anh chị địa phương, Sonny, do Palminteri đóng.

Mãi đến năm 2006 De Niro mới đạo diễn bộ phim thứ hai, The Good Shepherd với sự tham gia của hai ngôi sao Matt Damon và Angelina Jolie. The Good Shepherd khắc họa lại sự ra đời của CIA, trong đó Damon vào vai một nhân viên phản gián hàng đầu trong thời gian Chiến tranh thế giới thứ hai và Chiến tranh lạnh. De Niro cũng góp mặt trong một vai nhỏ, đó là vai tướng Bill Sullivan, người đã tuyển mộ nhân vật của Damon vào thế giới phản gián.